뱀독에는 카르복실 에스테르 결합을 가수분해하는 효소가 들어 있습니다.가수분해 기질은 인지질, 아세틸콜린 및 방향족 아세테이트입니다.이 효소에는 포스포리파아제, 아세틸콜린에스테라아제 및 방향족 에스테라아제의 세 가지 종류가 포함됩니다.뱀독의 아르기닌 에스테라제는 합성 아르기닌이나 라이신도 가수분해할 수 있지만, 주로 자연에서 단백질 펩타이드 결합을 가수분해하므로 프로테아제에 속한다.여기에서 논의된 효소는 에스테르 기질에만 작용하며 어떤 펩타이드 결합에도 작용할 수 없습니다.이들 효소 중에서 아세틸콜린에스테라아제와 포스포리파아제의 생물학적 기능이 더 중요하며 충분히 연구되었습니다.일부 뱀독은 p-니트로페닐 에틸 에스테르, 또는 P-나프탈렌 아세테이트 및 인돌 에틸 에스테르를 가수분해할 수 있는 강한 방향족 에스테라제 활성을 가지고 있습니다.이 활성이 독립적인 효소에 의해 생성되는지 아니면 생물학적 중요성은 고사하고 카르복실에스테라아제의 알려진 부작용에 의해 생성되는지는 아직 알려지지 않았습니다.Agkistrodon halys Japonicus의 독을 p-니트로페닐 에틸 에스테르 및 인돌 에틸 에스테르와 반응시켰을 때, p-니트로페놀 및 인돌 페놀의 가수분해물은 발견되지 않았다;반대로, 이 에스테르가 Cobra Zhoushan 아종 뱀독 및 Bungarus multicinctus 뱀독과 반응하면 빠르게 가수분해됩니다.이 코브라 독은 강한 콜린에스테라제 활성을 가지고 있으며, 이는 위 기질의 가수분해를 담당할 수 있는 것으로 알려져 있습니다.사실, Mclean et al.(1971)은 코브라과에 속하는 많은 뱀독이 인돌 에틸 에스테르, 나프탈렌 에틸 에스테르 및 부틸 나프탈렌 에스테르를 가수분해할 수 있다고 보고했습니다.이 뱀 독은 코브라, 검은 목 코브라, 검은 입술 코브라, 황금 코브라, 이집트 코브라, 킹 코브라, 황금 코브라 맘바, 검은 맘바 및 흰 입술 맘바에서 나옵니다.
뱀독은 혈청에서 콜린에스테라아제 활성을 결정하는 기질인 메틸 인돌 에틸 에스테르를 가수분해할 수 있지만, 이 뱀독은 콜린에스테라아제 활성을 나타내지 않습니다.이것은 코브라 독에 콜린에스테라아제와 다른 알려지지 않은 에스테라아제가 있음을 보여줍니다.이 효소의 특성을 이해하려면 추가 분리 작업이 필요합니다.
1, 포스포리파제 A2
(I) 개요
포스포리파아제는 글리세릴 포스페이트를 가수분해할 수 있는 효소입니다.자연계에는 5가지 종류의 포스포리파제, 즉 포스포리파제 A2와 포스포리파제가 있습니다.
A. , 포스포리파제 B, 포스포리파제 C 및 포스포리파제 D. 뱀독은 주로 포스포리파제 A2(PLA2)를 포함하고, 소수의 뱀독은 포스포리파제 B를 포함하며, 기타 포스포리파제는 주로 동물 조직과 박테리아에서 발견됩니다.그림 3-11-4는 기질 가수분해에 대한 이들 포스포리파제의 작용 부위를 보여준다.
포스포리파제 중에서 PLA2가 더 많이 연구되었습니다.뱀독에서 가장 많이 연구된 효소일 수 있습니다.그 기질은 Sn-3-글리세로포스페이트의 두 번째 위치에 있는 에스테르 결합입니다.이 효소는 뱀독, 봉독, 전갈독 및 동물 조직에서 널리 발견되며 PLA2는 4종의 뱀독에 풍부하다.이 효소는 적혈구를 파괴하여 용혈을 일으키기 때문에 "헤모리신"이라고도 합니다.어떤 사람들은 PLA2 용혈성 레시티나제라고도 부릅니다.
Ludeeke는 뱀독이 효소를 통해 레시틴에 작용하여 용혈성 화합물을 생성할 수 있음을 처음으로 발견했습니다.나중에 Delezenne et al.코브라 독이 말 혈청이나 노른자에 작용하면 용혈성 물질을 형성한다는 것을 증명했습니다.현재 PLA2는 적혈구 막의 인지질에 직접 작용하여 적혈구 막의 구조를 파괴하고 직접적인 용혈을 일으킬 수 있다는 것이 알려졌습니다.또한 혈청 또는 첨가된 레시틴에 작용하여 용혈성 레시틴을 생성할 수 있으며, 이는 적혈구에 작용하여 간접적인 용혈을 생성합니다.PLA2는 네 가지 뱀독 계열에 풍부하지만 다양한 뱀독의 효소 함량은 약간 다릅니다.방울뱀(C
뱀독은 약한 PLA2 활동만 보였다.표 3-11-11은 중국의 10가지 주요 독사의 PLA2 활동을 비교한 것입니다.
표 3-11-11 중국 뱀독 10종의 포스포리파제 VIII 활성 비교
뱀독
지방 방출
지방산,
추몰/mg)
용혈 활성 CHU50/^ g * ml)
뱀독
지방산 방출
(^라올/mg)
용혈 활성 "(HU50/ftg * 1111)
나자나자 아트라
9. 62
열하나
미크라세팔 오피스
5.10
칼리스팔라스
8. 68
이천팔백
박근
V, 급성
7. 56
* * #
오피오파구스 한나
3.8 2
백사십
Bnugarus fasctatus
7,56
이백 팔십
B. multicinctus
1.96
이백 팔십
바이퍼와 러셀리
칠 포인트 제로 쓰리
T, 점액종
1.85
샤멘시스
T. 스테네게리
0. 97
(2) 분리 및 정제
뱀독의 PLA2 함량이 많고 열, 산, 알칼리, 변성제에 안정하여 PLA2의 정제 및 분리가 용이하다.일반적인 방법은 먼저 미정제 독에 대해 겔 여과를 수행한 다음 이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 다음 단계를 반복할 수 있습니다.이온 교환 크로마토그래피 후 PLA2의 동결 건조는 응집을 일으키지 않아야 한다는 점에 유의해야 합니다. 동결 건조 공정은 종종 시스템의 이온 강도를 증가시키기 때문에 PLA2의 응집을 유발하는 중요한 요인입니다.위의 일반적인 방법 외에 다음과 같은 방법도 채택되었습니다. ① Wells et al.② 친화성 크로마토그래피를 위한 리간드로 PLA2의 기질 유사체를 사용하였다.이 리간드는 Ca2+로 뱀독에서 PLA2에 결합할 수 있습니다.EDTA는 주로 용리액으로 사용됩니다.Ca2+가 제거된 후 PLA2와 리간드 사이의 친화력이 감소하고 리간드에서 해리될 수 있습니다.기타는 용리액으로 30% 유기 용액 또는 6mol/L 요소를 사용합니다.③ PheiiylSephar0SeCL-4B로 소수성 크로마토그래피를 수행하여 심독소에서 미량의 PLA2를 제거하였다.④ 항 PLA2 항체를 리간드로 사용하여 PLA2에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행하였다.
지금까지 많은 수의 뱀독 PLAZ가 정제되었습니다.Tu et al.(1977)은 1975년 이전에 뱀독으로부터 정제된 PLA2를 나열하였다. 최근 몇 년 동안 PLA2의 분리 및 정제에 관한 다수의 기사가 매년 보고되었다.여기에서는 중국 학자들의 PLA 분리 및 정화에 초점을 맞춥니다.
Chen Yuancong et al.(1981)은 절강의 Agkistrodon halys Pallas의 독에서 3개의 PLA2 종을 분리했는데, 이는 등전점에 따라 산성, 중성 및 알칼리성 PLA2로 나눌 수 있습니다.그 독성에 따르면 중성 PLA2는 더 독성이 있으며 시냅스 전 신경독인 Agkistrodotoxin으로 확인되었습니다.알칼리성 PLA2는 독성이 적고 산성 PLA2는 독성이 거의 없습니다.Wu Xiangfu et al.(1984)는 분자량, 아미노산 조성, N-말단, 등전점, 열 안정성, 효소 활성, 독성 및 용혈 활성을 포함한 세 가지 PLA2의 특성을 비교했습니다.결과는 분자량과 열 안정성이 비슷하지만 다른 측면에서 상당한 차이가 있음을 보여주었습니다.효소활성면에서는 산성효소활성이 알칼리성효소활성보다 높았고;쥐의 적혈구에 대한 알카리성 효소의 용혈효과가 가장 강했고, 중성효소, 산성효소가 거의 용혈되지 않았다.따라서 PLAZ의 용혈 효과는 PLA2 분자의 전하와 관련이 있는 것으로 추측된다.Zhang Jingkang et al.(1981)은 Agkistrodotoxin 결정체를 만들었다.Tu Guangliang et al.(1983)은 등전점이 7.6인 독성 PLA를 복건성 Vipera rotundus의 독으로부터 분리 정제하여 그 물리화학적 성질, 아미노산 조성 및 N 위치의 22개 아미노산 잔기의 서열을 보고하였다. -터미널이 결정되었습니다.Li Yuesheng et al.(1985)는 Fujian의 Viper rotundus 독에서 또 다른 PLA2를 분리 및 정제했습니다.PLA2*의 서브유닛은 13,800, 등전점은 10.4, 비활성은 35/xnioI/miri mg이다. 레시틴을 기질로 하여 효소의 최적 pH는 8.0, 최적 온도는 65℃ LD5를 마우스에 정맥 주사하였다.0.5 ± 0.12mg/kg입니다.이 효소는 명백한 항응고 및 용혈 효과가 있습니다.독성 PLA2 분자는 18종의 아미노산 123개 잔기로 구성되어 있습니다.이 분자는 시스테인(14), 아스파르트산(14) 및 글리신(12)이 풍부하지만 메티오닌은 하나만 포함하고 N-말단은 세린 잔기입니다.Tuguang에 의해 분리된 PLA2와 비교하여 두 isoenzyme의 분자량과 아미노산 잔기의 수는 매우 유사하고 아미노산 조성도 매우 유사하지만 aspartic acid와 proline 잔기의 수는 다소 다릅니다.광시 킹 코브라 뱀 독에는 풍부한 PLA2가 포함되어 있습니다.Shu Yuyanet al.(1989)는 원래 독보다 3.6배 높은 비활성, 13000의 분자량, 122개의 아미노산 잔기 구성, 8.9의 등전점 및 우수한 열 안정성을 가진 PLA2를 독에서 분리했습니다.염기성 PLA2가 적혈구에 미치는 영향을 전자현미경으로 관찰한 결과 사람의 적혈구 세포막에는 뚜렷한 영향을 주지만 염소 적혈구에는 뚜렷한 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.이 PLA2는 인간, 염소, 토끼 및 기니피그에서 적혈구의 전기 영동 속도에 명백한 지연 효과를 나타냅니다.Chenet al.이 효소는 ADP, 콜라겐 및 나트륨 아라키돈산에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제할 수 있습니다.PLA2 농도가 10/xg/ml~100jug/ml일 때 혈소판 응집이 완전히 억제된다.세척된 혈소판을 재료로 사용하면 PLA2는 20Mg/ml 농도에서 응집을 억제할 수 없었다.아스피린은 혈소판에 대한 PLA2의 효과를 억제할 수 있는 시클로옥시게나제 억제제입니다.PLA2는 아라키돈산을 가수분해하여 트롬복산 A2를 합성함으로써 혈소판 응집을 억제할 수 있습니다.Zhejiang Province의 Agkistrodon halys Pallas venom에 의해 생성된 PLA2의 용액 구조는 원형 이색성, 형광 및 UV 흡수를 통해 연구되었습니다.실험 결과, 이 효소의 주쇄 형태는 다른 종 및 속의 같은 종류의 효소와 유사하고, 골격 형태는 내열성이 양호하며, 산성 환경에서 구조적 변화는 가역적이었다.활성제 Ca2+와 효소의 조합은 트립토판 잔기의 환경에 영향을 미치지 않는 반면, 억제제 Zn2+는 그 반대입니다.용액의 pH 값이 효소 활성에 영향을 미치는 방식은 위의 시약과 다릅니다.
뱀독의 PLA2 정제 과정에서 분명한 현상은 뱀독이 두 개 이상의 PLA2 용출 피크를 포함한다는 것입니다.이 현상은 다음과 같이 설명할 수 있다. ① isozymes의 존재로 인해;② 한 종류의 PLA2는 다양한 분자량을 가진 다양한 PLA2 혼합물로 중합되며, 대부분은 9,000~40,000 범위입니다.③ PLA2와 다른 뱀독 성분의 조합은 PLA2를 복잡하게 만듭니다.④ PLA2의 아미드 결합이 가수분해되어 전하가 변한다.① 및 ②는 CrWa/w 뱀 독의 PLA2와 같은 몇 가지 예외를 제외하고 일반적입니다.
①과 ②의 두 가지 상황이 있습니다.세 번째 조건은 PLA2에서 다음 뱀의 독에서 발견되었습니다.
④의 경우 전기영동시 PLA2의 이동속도는 변하지만 아미노산 조성은 변하지 않는다.펩타이드는 가수분해에 의해 분해될 수 있지만 일반적으로 여전히 이황화 결합에 의해 서로 결합되어 있습니다.동부 구덩이 방울뱀의 독에는 각각 유형 a 및 유형 p PLA2라고 하는 두 가지 형태의 PLA2가 포함되어 있습니다.이 두 유형의 PLA2 사이의 차이점은 하나의 아미노산, 즉 한 PLA2 분자의 글루타민이 다른 PLA2 분자의 글루탐산으로 대체된다는 것입니다.이 차이에 대한 정확한 이유는 명확하지 않지만 일반적으로 PLA2의 탈아미노화와 관련이 있는 것으로 여겨진다.팔레스타인 살모사 독의 PLA2가 원유 독으로 따뜻해지면 효소 분자의 말단 그룹이 이전보다 많아집니다.C에서 뱀독에서 분리된 PLA2는 두 개의 다른 N-말단을 가지고 있으며 분자량은 30000입니다. 이 현상은 PLA2의 비대칭 이량체가 원인일 수 있으며, 이는 동부 다이아몬드등 방울뱀의 독에서 PLA2에 의해 형성된 대칭 이량체와 유사합니다. 서부 다이아몬드 방울뱀.아시아 코브라는 많은 아종으로 구성되어 있으며 그 중 일부는 분류가 명확하지 않습니다.예를 들어, Cobra Outer Caspian 아종이라고 불렸던 종은 이제
외부 카스피해 코브라에 기인해야 합니다.많은 아종이 있고 함께 혼합되어 있기 때문에 뱀 독의 구성은 소스가 다르기 때문에 크게 다르며 PLA2 동위 효소의 함량도 높습니다.예를 들어, 코브라 독
r ^ ll 종의 PLA2 동위효소가 9종 이상 발견되었으며, 코브라 아종 Caspian의 독에서 7종의 PLA2 동위효소가 발견되었습니다.Durkinet al.(1981)은 18개의 코브라 독, 3개의 맘바 독, 5개의 독사 독, 16개의 방울뱀 독 및 3개의 바다뱀 독을 포함하여 다양한 뱀 독에서 PLA2 함량 및 동종 효소의 수를 연구했습니다.일반적으로 코브라 독의 PLA2 활성은 높으며 동위 효소가 많습니다.바이퍼 독의 PLA2 활성 및 동위 효소는 중간입니다.맘바 독과 방울뱀 독의 PLA2 활동은 매우 낮거나 PLA2 활동이 없습니다.바다뱀 독의 PLA2 활동도 낮습니다.
최근 몇 년 동안 뱀독의 PLA2가 동부 rhombophora 방울뱀과 같은 활성 이합체 형태로 존재한다는 보고는 없었습니다(C. snake venom은 유형 a 및 유형 P PLA2를 포함하며, 둘 다 두 개의 동일한 하위 단위로 구성됩니다. , 그리고 오직 dimerase만이
활동.Shenet al.또한 뱀 독의 PLA2의 이량체만이 효소의 활성 형태라고 제안했습니다.공간 구조에 대한 연구는 또한 서부 다이아몬드 방울뱀의 PLA2가 이합체 형태로 존재한다는 것을 증명합니다.식충 화합물
뱀독에는 PLA^Ei와 E2가 있는데, 仏은 이량체 형태로 존재하고, 이량체는 활성 상태이며, 해리된 단량체는 비활성 상태입니다.Lu Yinghua et al.(1980)은 E. Jayanthi et al.(1989)는 바이퍼 독에서 기본 PLA2(VRVPL-V)를 분리했습니다.모노머 PLA2의 분자량은 10000이며 치사, 항응고 및 부종 효과가 있습니다.효소는 PH 4.8의 조건에서 분자량이 다른 고분자를 중합할 수 있으며 온도가 증가함에 따라 고분자의 중합도와 분자량이 증가합니다.96℃에서 생성된 폴리머의 분자량은 53,100이며, 이 폴리머의 PLA2 활성도는 2배 증가한다.
게시 시간: 2022년 11월 18일